Den tidligere catalanske vicepræsident Oriol Junqueras, der sidder fængslet, var som valgt europaparlamentsmedlem berettiget til immunitet.
Det siger EU-Domstolen i en afgørelse torsdag formiddag.
Det betyder blandt andet, at separatistlederen skulle have været løsladt, så han kunne indtage sin rolle i EU-Parlamentet.
Junqueras, der blev fængslet som følge af løsrivelseskrisen i Catalonien i 2017, blev valgt til EU-Parlamentet ved europaparlamentsvalget i maj. Han fik dog ikke lov til at forlade fængslet og blive indlemmet i parlamentet.
Men det burde han ifølge EU-Domstolen.
Den siger, at Junqueras havde immunitet, der "løfter alle foreløbige tilbageholdelser, der er foretaget forud for valget af et medlem".
Det catalanske separatistparti ERC har straks efter EU-Domstolens afgørelse forlangt, at Junqueras bliver løsladt.
Oriol Junqueras blev i oktober idømt 13 års fængsel ved Spaniens højesteret for sin rolle under Cataloniens løsrivelsesforsøg i efteråret 2017. Otte andre tidligere separatistledere blev også idømt mellem ni og 13 års fængsel.
De blev dømt for tilskyndelse til optøjer.
Højesteretsdommen har ført til store uroligheder og demonstrationer i den catalanske hovedstad, Barcelona.
Senest stødte demonstranter og politi onsdag sammen i forbindelse med fodboldkampen mellem hovedstadsklubben Real Madrid og FC Barcelona.
46 personer kom til skade under urolighederne, og ni personer blev anholdt. Det oplyser myndighederne ifølge nyhedsbureauet AFP.
Separatistpartiet ERC kræver efter torsdagens dom, at retssagen, der endte med 13 års fængsel til Junqueras, skal gå om.
Catalonien afholdt den 1. oktober 2017 en folkeafstemning om løsrivelse fra det øvrige Spanien. Afstemningen var på forhånd erklæret forfatningsstridig af den spanske forfatningsdomstol.
Afstemningen udløste en af de værste politiske kriser i Spanien i mange år.
/ritzau/